Diagnóstico de estafilococos (pruebas de laboratorio) y epidemiología (dónde vive)

¿Dónde vive S. aureus?

S. aureus vive en:

• Personas sanas ( portadores de S. aureus ): en la mucosa de la nariz , con menos frecuencia en la garganta, la vagina, los intestinos y los pulmones; en la piel : principalmente en las axilas, debajo de los senos y en la ingle
• Personas infectadas : en lesiones cutáneas, sangre, heces, orina, mucosa respiratoria, genitales, abscesos de órganos internos.
• Animales : en mascotas (pelaje, piel, narinas) y animales de granja (ubres de vacas, caballos, aves de corral)
• Alimentos contaminados : leche (de vaca infectada), alimentos preparados y conservados fuera de un refrigerador durante algunas horas (contaminación por trabajador de alimentos infectado)
• Equipo deportivo , juguetes, superficies y otros objetos inanimados conocidos como fomites.
• Aire, agua, suelo, polvo (fuentes menos importantes).

Depósito de estafilococos

El reservorio principal de S. aureus (incluido MRSA) es un ser humano. El estafilococo es común en vacas (mastitis), aves de corral y mascotas (perros, gatos). En Canadá, han encontrado MRSA en cerdos ( 1 ).

¿Cómo se propaga la infección por estafilococos?

El estafilococo se puede propagar de un lugar de la piel a otro ( autoinfección ), por ejemplo, al pellizcarse la nariz y luego rascarse la piel o con la ropa. La propagación de persona a persona es posible a través del contacto de piel a piel, o al compartir juguetes, toallas, equipos deportivos, duchas públicas, sauna o piscinas. Una infección también puede ser transmitida por portadores de estafilococos sanos , especialmente por el personal de salud. El estafilococo puede transmitirse de humanos a perros u otras mascotas y luego de regreso a los humanos ( 2 ). S. aureus se puede encontrar en la piel, el pelo, las fosas nasales o la saliva de los perros. Se informó endocarditis grave por estafilococos después de una mordedura de perro menor ( 3 ). Infección por ordeñar una vacatener mastitis por estafilococos es posible ( 4 ). La intoxicación alimentaria por estafilococos puede ocurrir después de ingerir alimentos contaminados con estafilococos, liberados por un trabajador de alimentos infectado.

Los puntos de entrada de la infección por estafilococos son:

• Piel: folículo piloso durante traumatismos menores por afeitado o depilación, acné, eccema (psoriasis, dermatitis atópica), lesiones cutáneas, quemaduras, inyecciones, perforaciones y tatuajes, catéteres vasculares y urinarios, heridas quirúrgicas;
• Tracto respiratorio : la neumonía estafilocócica puede ser una complicación de la influenza o la aspiración.

Continuo de la granja a la mesa de S. aureus

El estafilococo puede sobrevivir en animales domésticos como perros, gatos y caballos, y puede causar un zumbido en los pollos y mastitis en las vacas. Cuando las bacterias ingresan a la leche o la carne, se multiplican y liberan toxinas. La intoxicación alimentaria es posible incluso con leche cocida, helado o carne ahumada, como salami, ya que las toxinas de S. aureus no se destruyen con el calor.

¿Quién está en riesgo de contraer una infección por estafilococos?

Estos son:

• Personas con un sistema inmunológico débil: niños pequeños, ancianos en hogares de ancianos, diabéticos, pacientes con cáncer o SIDA, y aquellos en terapia inmunosupresora o diálisis.
• Pacientes hospitalizados con heridas quirúrgicas, quemaduras, traumatismos, sondas de alimentación, catéteres, prótesis articulares o válvulas cardíacas.
• Personal sanitario
• Adictos a las drogas intravenosas
• Madres que amamantan
• Atletas
• Soldados, prisioneros y otras personas que viven en comunidades hacinadas
• Los agricultores pueden infectarse por mastitis en las vacas

Período de incubación de S. aureus

El período de incubación de la infección por S. aureus puede variar mucho, pero comúnmente es de 4 a 10 días ( 5 ). El período de incubación en la intoxicación alimentaria por estafilococos es de 30 minutos a 8 horas ( 6 ).

Incidencia y mortalidad de la infección por estafilococos

En Estados Unidos, en y. En 2006, aproximadamente el 32% de la población estaba colonizada por S. aureus y el 0,8% por MRSA. MRSA causa alrededor de 94.000 infecciones graves y alrededor de 19.000 muertes en los EE. UU. Cada año ( 7 ).

Referencias:

1. MRSA en cerdos (thepigsite.com)
2. Propagación de S. aureus entre humanos, animales y humanos (cdc.gov)
3. La mordedura de perro resultó en endocarditis staoh (medscape.com)
4. Mastitis por estafilococos en vacas (usjersey.com)
5. Período de incubación de S. aureus (cinetwork.com)
6. Período de incubación de intoxicación alimentaria por estafilococos (drgreene.com)
7. Morbilidad y mortalidad por S. aureus en Estados Unidos (cdc.gov)

Diagnóstico de una infección por estafilococos

1. Obtención de una muestra de tejido infectado

Para un diagnóstico de infección por estafilococos, debe obtenerse una muestra de una lesión infectada (secreción nasal, pus, sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, aspirado de células de los pulmones o del hueso). Los síntomas de las infecciones por estafilococos a menudo son causados ​​por toxinas , liberadas solo por unos pocos estafilococos, por lo que un cultivo de una lesión obviamente infectada puede ser negativo. Por esta razón, se deben proporcionar muestras de más de una lesión, si es posible.

¿Qué es Staphylococcus aureus?
Imágenes de foliculitis estafilocócica

2. Tinción de Gram

Se coloca una muestra clínica en un portaobjetos y se enjuaga con:

1. Cristal violeta
2. Solución de yodo (el mordiente)
3. Decolorante (etanol)
4. Safranin (la contratinción)
5. Agua

Después de este procedimiento, S. aureus y otros estafilococos deben ser de color azul, violeta o violeta bajo el microscopio óptico, lo que se indica como Gram-positivo (Gram +), ( Imagen 1 ). Las bacterias de color rosa claro se señalan como Gram negativas (Gram -), ( 1 ). La tinción de Gram se realiza únicamente cuando se espera una infección mixta con bacterias Gram + y Gram -.

Imagen 1 . S. aureus grampositivo ,
microscopio óptico, Magn. ~ 100x
(fuente: phil.cdc.gov)

3. Cultivo de Staphylococcus aureus

Cuando se espera estafilococo, una parte de una muestra médica se esparce sobre el agar tripticasa de soja (TSA) con sangre de carnero al 5% (BAP = placa de agar sangre), ( 2 ). En tal agar, S. aureus forma colonias de color amarillo dorado (blanco crema a naranja), ( 3 ), mientras que S. epidermidis forma colonias blancas ( Imagen 2 ). El cultivo suele necesitar de 16 a 18 horas para crecer (hasta 48 horas para el hemocultivo) a 35 ° C ( 4 ). S. aureus  suele ser hemolítico en sangre de oveja y S. epidermidis no es. En muestras mixtas que contienen bacterias Gram + y -, se puede utilizar una placa CNA basada en agar Columbia (colisitina / ácido naladíxico) para suprimir el crecimiento de Gram negativos.

Imagen 2. Cultivo de estafilococos: colonia de S. aureus
dorado  y S. epidermidis blanca .

4. Pruebas de enzimas

a) La  prueba de catalasa se realiza agregando peróxido de hidrógeno al 3% a una colonia en agar. Los estafilococos contienen catalasa, y descomponen el peróxido, producen O ₂ y burbujean, por lo que son catalasa positivos , lo que los distingue de los estreptococos. La prueba de catalasa se realiza solo cuando un cultivo no es típico.

b) Prueba de coagulasa . S. aureus (y S. intermedius , que no es patógeno para el ser humano) causa la coagulación (coágulo de fibrina) del plasma de un conejo, por lo que es coagulasa positivo , lo que lo distingue de todos los demás estafilococos. En la prueba de aglutinación de látex ( prueba de portaobjetos ), se utilizan partículas de látex cubiertas con fibrinógeno e IgG. Los anticuerpos IgG se unen a la coagulasa en S. aureus , lo que hace que las partículas de látex se agrupen en unos 20 segundos ( 5 ). Esta prueba de portaobjetos puede ser negativa en un pequeño porcentaje; en este caso, se debe realizar una prueba de tubo , que detecta coagulasa libre y unida (5 ). Aproximadamente el 97% de los  aislados de S. aureus humanos poseen ambas formas de coagulasa ( 6 ).

c) Hemólisis . S. aureus causa hemólisis en agar sangre, pero S. epidermidis no. Sin  embargo, algunas cepas de S. aureus no son hemolíticas ( 7 ).

5. Diagnóstico rápido de Staphylococcus aureus con PCR

La detección rápida de S. aureus es posible mediante pruebas que utilizan la  reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) , también llamada PCR en tiempo real .

Principio de PCR

En las muestras clínicas, S. aureus  está presente en cantidades que no son suficientes para ser determinadas con exactitud por cualquier método de prueba, por lo que las bacterias deben multiplicarse mediante cultivo, lo que generalmente toma de 1 a 4 días. Con una PCR, se pueden obtener unos pocos millones de copias de ADN de S. aureus directamente de una muestra clínica (no se necesita cultivo) en unas pocas horas.

Procedimiento de PCR

Una muestra de ADN de estafilococo, polimerasa, una enzima necesaria para la duplicación del ADN, una secuencia de nucleótidos (cebador), necesaria para el inicio de la duplicación, y una gran cantidad de nucleótidos libres son necesarios para la PCR. La polimerasa se obtiene de una bacteria  Thermus aquaticus  (polimerasa Taq). Todos los componentes se agregan a un tubo de ensayo, que se coloca en un termociclador. Después de algunos ciclos de PCR, se utiliza la electroforesis en gel de agarosa y la técnica de transferencia Southern para determinar si el ADN obtenido es de S. aureus ( 8 ).

6. Kits de detección de Staphylococcus aureus

Los kits para la detección de diversas especies de estafilococos o sus toxinas a partir de tejidos humanos, alimentos, leche de vaca, agua y otras fuentes ambientales, están disponibles comercialmente.

Ejemplos de kits, basados ​​en aglutinación,  para la detección de MRSA  en muestras clínicas (después del cultivo) son: prueba Dry Spot Staphytect Plus ^® , prueba Pastorex Staph Plus ^® , Slidex Staph-Kit ^® , Slidex Staph Plus ^® prueba, StaphaurexPlus ^® prueba y la prueba de estafilasa ^® . La especificidad y sensibilidad de estos kits fue evaluada por tres institutos de salud alemanes en y. 2005 ( 9 ).

Las pruebas Xpert ™ MRSA / SA-Blood Cultures (BC) y Xpert ™ MRSA / SA-Skin and Soft Tissue Infection (SSTI) pueden detectar simultáneamente MRSA y  S. aureus  directamente de hemocultivos y muestras de tejido blando infectado, mediante PCR . Ambas pruebas dan resultados en aproximadamente 50 minutos  ( 10 ).

Los alimentos pueden analizarse para detectar enterotoxinas estafilococos mediante ELISA. La presencia de la   bacteria S. aureus en los alimentos puede confirmarse mediante TAQMAN (PCR) o  Slidex Staph Kit (aglutinación de látex) ( 11 ).

La leche se puede analizar para detectar mastitis de vaca mediante Bulk Tank Culture (BTC), California Mastitis Test (CMT) y, específicamente, para detectar mastitis por estafilococo mediante la prueba de anticuerpos de la leche Prostaph © ( 12 ). Se desarrolló el ensayo de PCR multiplex en tiempo real para la detección simultánea de Staphylococcus aureus , Streptococcus agalactiae y Streptococcus uberis directamente de la leche ( 13 ). La prueba tarda 24 horas en completarse.

El agua, para ser analizada para S. aureus , se filtra y luego la membrana filtrante se coloca en agar con sal de manitol modificado para su cultivo ( 14 ).

7. Prueba de sensibilidad a antibióticos de Staphylococcus aureus

S. aureus de una lesión infectada debe cultivarse en un medio sólido y luego prepararse una suspensión adecuada a partir de pocas colonias en crecimiento. La suspensión con bacterias se frota sobre un agar Mueller-Hinton ( imagen 3 ), ( 15 ). Los discos impregnados con varios antibióticos se colocan en agar y se incuban durante 24 horas a 35 ° C. Las zonas de inhibición del crecimiento bacteriano, medidas alrededor de los discos, deben compararse con las del Documento M100 (M2) del Comité Nacional de Estándares de Laboratorio Clínico (NCCLS). Los resultados obtenidos pueden entonces notificarse como resistentes, intermedios o susceptibles.

Imagen 3. Prueba de sensibilidad a antibióticos de S. aureus .
Se ven áreas de crecimiento bacteriano inhibido alrededor de los discos de antibióticos.
(fuente: phil.cdc.gov)

Formulario de informe de microbiología para S. aureus

A continuación se muestran tres ejemplos de informe de microbiología, completado por un microbiólogo después de las pruebas de laboratorio y enviado al médico del paciente.

a) Informe de un drenaje de un carbunco cutáneo, infectado por S. aureus:

Origen (ubicación anatómica): drenaje del absceso del cuello
Tinción de Gram: muchos cocos gram positivos. Fuerte crecimiento. Muchos glóbulos blancos (la presencia de glóbulos blancos indica inflamación).
Organismo: Staphylococcus aureus
Susceptibilidad antibiótica:

Antibiótico	MIC * (µg / ml)	SIGNIFICADO**
Ampicilina / sulbactam	<4	S
Cefalotina	<2	S
Ciprofloxacina	<0,5	S
Clindamicina	<0,5	S
Eritromicina	<0,5	S
Oxacilina	<2	S***
Penicilina G	> 16	R
Tetraciclina	<1	S
Trimeth-sulfa	<10	S
Vancomicina	<0,5	S

* MIC (Concentración mínima inhibitoria) = la concentración más baja de agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento del microbio. La CMI se determina agregando cantidades crecientes de antibiótico (método de titulación) a la muestra médica.
** SENS = sensibilidad; S = sensible, R = resistente.
*** Las bacterias de la muestra anterior eran sensibles a la oxacilina, por lo que esta es una SA susceptible a la meticilina (SA “normal”). Para determinar la resistencia a la meticilina, se usa oxacilina en lugar de meticilina, porque la meticilina ya no está disponible comercialmente en los Estados Unidos y porque la oxacilina mantiene su actividad durante el almacenamiento mejor que la meticilina ( 16 ).

b) Informe de sangre infectada por MRSA:

Fuente :
tinción de Gram en sangre : muchos leucocitos. Pocos cocos gram positivos. Crecimiento ligero.
Organismo : Staphylococcus aureus
Susceptibilidad antibiótica :

Antibiótico	MIC * (µg / ml)	SIGNIFICADO
Ampicilina / sulbactam	> 32	R
Cefalotina	> 32	R
Ciprofloxacina	> 4	R
Clindamicina	<0,2	S
Eritromicina	> 8	R
Oxacilina	4	R *
Penicilina G	> 16	R
Tetraciclina	> 16	R
Trimeth-sulfa	1	S
Vancomicina	1	S

* Se necesitaba una dosis alta de oxacilina para inhibir las bacterias, por lo que se considera un estafilococo resistente a la meticilina: MRSA. 

c) Informe de frotis nasal, COLONIZADO por S. aureus:

Fuente : mucosa nasal
Tinción de Gram: cocos Gram positivos. Crecimiento ligero. Sin leucocitos *
Organismo : Staphylococcus aureus
Susceptibilidad a los antibióticos :

Antibiótico	MIC * (µg / ml)	SIGNIFICADO
Ampicilina / sulbactam	<4	S
Cefalotina	<2	S
Ciprofloxacina	> 4	R
Clindamicina	<0,2	S
Eritromicina	<0,2	S
Oxacilina	<0,2	S
Penicilina G	<0,2	S
Tetraciclina	1	S
Trimeth-sulfa	1	S
Vancomicina	1	S

• ¿Qué es Staphylococcus aureus?
• ¿Qué es Staphylococcus epidermidis?
• Tipos de superbacterias MRSA
• Microorganismos: tipos, imágenes

Referencias: 

1. Tinción de Gram (dcccd.edu)
2. Experto en laboratorio de microbiología   (prep4usmle.com, miembro ‘bactitech’)
3. S. aureus no siempre es amarillo (microbiology.mtsinai.on.ca)
4. Tiempo de crecimiento del cultivo de estafilococos (cinetwork.com)
5. Prueba de Stapyloslide (bd.com)
6. Factores de virulencia de estafilococos, toxinas superantígenas (utmb.edu)
7. Cepas no hemolíticas de S. aureus   (cdc.gov)
8. PCR (bionewsonline.com)
9. Prueba rápida simultánea de SA / MRSA   (rapidmicrobiology.com)
10. Taqman, kits para la detección de S. aureus en alimentos   (foodhaccp.com)
11. Diagnóstico de mastitis de la vaca (fass.org)
12. Detección de S. aureus en agua (hpa-standardmethods.org.uk)
13. Agar Mueller-Hinton (bd.com)
14. ¿Por qué se usa oxacilina en lugar de meticilina para detectar MRSA?   (cdc.gov)